Иммунологические методы диагностики африканской чумы свиней

В странах с развитым свиноводством наряду с унификацией базовых технологий производства свинины, диагностика и эпизоотологический мониторинг инфекционных болезней достигли исключительно широких масштабов. В отношении Африканской чумы свиней (АЧС) регулярный мониторинг домашних и диких свиней на территории РФ является одной из самых важных мер, направленных на раннюю диагностику болезни и контроль за распространением вируса. Согласно стандартам Всемирной организации здравоохранения животных (OIE) диагностические исследования на АЧС должны быть направлены как на идентификацию возбудителя (выделение вируса, выявление вирусного антигена, выделение и детекция геномной ДНК), так и на выявление вирусспецифических антител.

При выборе тестов следует учитывать эпидемиологическую ситуацию в конкретном регионе, форму протекания болезни и возможную вирулентность возбудителя. В структуре лабораторных исследований на АЧС важное местно занимают иммунологические методы, направленные как на выявление антител, так и на детекцию вируса в исследуемом материале. К данным методам, различающимся по механизму оценки взаимодействия в системе антиген-антитело и характеру образования иммунного комплекса, относятся:

– Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – заключается в использовании меченных флюоро-хромом антител и последующей детекции комплекса антиген — антитело под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома.

– Реакция прямой иммунофлюоресценции (РПИФ) – используют для выявления вирусного антигена АЧС в срезах и культуре клеток, метод непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) используется для выявления антител.

– Иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее распространенным и эффективным диагностическим методом, основанным на использовании антител или антигенов, конъюгированных с ферментами (пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой и др.). Подобно РИФ, различные варианты ИФА (прямой, непрямой, конкурентный и «сэндвич») применяют для качественного или количественного определения антигенов или антител.

– Иммунохроматографический метод (ИХМ) представляет собой гомогенный вариант ИФА, проводимый на мембранном пористом носителе за счет латеральной диффузии реагентов. ИХМ является наиболее экспрессным и простым в постановке тестом и предназначен для быстрого и одностадийного выявления вирусного антигена или антител с использованием хроматографических мембран (иммунострипов) в качестве твердого носителя и иммобилизованных на них в различных зонах антител, одни из которых мечены коллоидным золотом или другим маркером. В идеальном варианте метод по чувствительности и специфичности не уступает гетерогенному ИФА, а по простоте постановке и удобству в использовании – превосходит все ныне существующие диагностические методы.

– Иммуноблоттинг (ИБ) применяют для выявления антител к отдельным антигенам или распознавания антигенов с помощью известных антител. Метод состоит из 3 этапов: разделения биологических макромолекул на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле; переноса разделенных белков из геля на твердую подложку, например на нитроцеллюлозную мембрану (блот); и последующего выявления на подложке искомых белков с помощью прямого или непрямого ИФА. В случае АЧС, диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному или нескольким белкам внешней оболочки вируса.

При выявлении антител к вирусу АЧС, согласно рекомендациям OIE, ИФА используется в качестве основного скринирующего теста, а РНИФ и ИБ – в качестве подтверждающего.

– Кроме того, к иммунологическим методам относят реакцию гемадсорбции, основанную на эффекте адгезии эритроцитов свиньи с поверхностью клеток моноцитов (макрофагов), инфицированных вирусом АЧС.

В последние годы, наряду с молекулярно-биологическими (ПЦР), иммунологические методы стали практически рутинными тестами в лабораторной диагностике АЧС, однако продолжается поиск и разработка новых подходов, направленных на экспресс-диагностику АЧС в «полевых условиях». Такие разработки базируются на создании ИХМ тестов, позволяющих быстро и эффективно провести предварительные (скринирующие) исследования на АЧС в условиях фермы.

Разработка новых иммунологических подходов для экспресс-диагностики АЧС

В настоящее время существует ИХМ-набор, разработанный испанской фирмой Ingenasa, предназначенный для выявления антител к вирусу АЧС (PPA-CROM) – рис.1.


По результатам экспериментов, направленных на оценку практической эффективности ИХМ, было установлено, что по чувствительности и специфичности тест не уступает традиционному гетерогенному ИФА и иммуно-блоттингу. Одними из последних разработок в этом направлении являются работы по созданию ИХМ-теста для выявления антигена вируса АЧС в биологическом материале животных. В этом случае на первом этапе разрабатывается и испытывается соответствующий гетерогенный вариант ИФА в формате «сэндвич», и только после этого осуществляется разработка самого ИХМ-теста.

Разработка «сэндвич»-ИФА для выявления антигена вируса АЧС

Первым ИФА-набором, разработанным в этой области, является набор INGEZIM PPA DAS (Ingenasa), созданный на основе двух моноклональных антител (МкА) к белку vp73 вируса АЧС. С использованием отечественной пары МкА к белку vp73 в АНО «НИИ ДПБ» была разработана аналогичная тест-система и создан ИФА-набор (АЧС-ИФА), предназначенный для выявления антигена вируса АЧС. Обе тест-системы относятся к «сэндвич»- варианту ИФА и основаны на использовании подобранных в оптимальной комбинации захватывающих (сорбированных на планшете) и детектирующих (конъюгированных с пероксидазой) МкА. Чувствительность метода составляет 5-10 нг/мл белка (рис.2).

Рис.2. Оценка чувствительности набора «АЧС-ИФА» по отношению к рекомбинантному белку vp73 вируса АЧС.

При проведении сравнительных испытаний по оценке чувствительности и специфичности тест-систем INGEZIM PPA DAS и АЧС-ИФА (ГУКК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» г. Кропоткин, Краснодарский край) была использована панель биологического материала, состоящая из проб селезенки и цельной крови от здоровых, павших и вынужденно убитых свиней, предварительно исследованных методом ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) (рис.3). Анализ экспериментальных данных показал, что все пробы, отнесенные к положительным или отрицательным по результатам РВ-ПЦР в двух тест-системах (ГНУ «ВНИИВВиМ» и АНО «НИИ ДПБ»), являлись положительными или отрицательными и в «сэндвич»-ИФА. При этом установлена 100% совпадение результатов, полученных с помощью INGEZIM PPA DAS- и АЧС-ИФА-наборов, что свидетельствует о высоком потенциале их использования в лабораторной практике для диагностики АЧС.

Рис.3. Сравнительная оценка чувствительности и специфичности ИФА-наборов INGEZIM PPA DAS и «АЧС-ИФА» при исследовании ПЦР-охарактеризованных проб.

Предварительно, можно предположить, что в случае высокого содержания вируса АЧС в биологическом материале инфицированных животных, практическая эффективность применения ИФА может быть сопоставима с ПЦР, однако это требует дальнейшего подтверждения. Таким образом, результаты многолетних исследований по созданию и практической апробации INGEZIM PPA DAS- и АЧС-ИФА-наборов являются предпосылкой для разработки эффективных ИХМ-тестов, предназначенных для экспресс -обследования поголовья на АЧС.

О.А.Верховский
доктор биологических наук, профессор

Leave a comment