Экспериментальное обоснование пероральной иммунизации свиней против сальмонеллеза

Сальмонеллезы все еще широко распространены в животноводческих хозяйствах и наносят отрасли существенный экономический ущерб. В последние 5 лет доля сальмонеллезов в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота составляла 2,3-3,8%, мелкого рогатого скота– 2,5-9,9%, свиней – 3,4-14,1%, птицы – 1,4-2,2%. Сальмонеллезы представляют и значимую социальную проблему, являясь причиной массовых вспышек пищевых токсикоинфекций у людей. Для специфической профилактики болезни используют живые вакцины из аттенуированных штаммов или инактивированные на основе цельноклеточных антигенов. Живые вакцины более иммуногенны чем инактивированные, но многократные пассажи аттенуированных штаммов на животных с вторичными иммунодефицитами ведут к их реверсии в исходное вирулентное состояние, что нередко заканчивается вспышками болезни на вакцинированном поголовье. Инактивированные вакцины не обладают достаточной иммуногенностью. Увеличение прививочных доз данных препаратов в большинстве случаев невозможно из-за их значительной реактогенности, которую связывают с эндотоксином возбудителя. В крупных свиноводческих предприятиях животных вакцинируют против целого ряда болезней бактериальной и вирусной этиологии. Этот затратный и трудоемкий процесс можно облегчить при условии использования групповых методов иммунизации, таких, как аэрозольный или пероральный, нашедших широкое применение преимущественно в птицеводстве и, в меньшей степени, в других отраслях животноводства.

Цель исследований заключалась в изучении возможности перорального применения лизат-антигенов сальмонелл для создания у свиней специфического иммунитета к возбудителю болезни.Лизат-антигены готовили по методу НИИВС им. Мечникова, разработан-ному для шигелл и других микроорганизмов. Для этого использовали штаммы S.typhimurium № 415 и S.choleraesuis № 370, характеризовавшиеся стабильностью основных биологических свойств, антигенных характеристик и высокой вирулентностью.

В начале исследований было показано, что антигены из лизированных клеток сальмонелл обоих сероваров менее реактогенны (в 3,6-6,1 раза) в сравнении с корпускулярными при всех испытанных способах их введения белым мышам (табл. 1). Оба варианта антигенов наиболее реактогенны при внутрибрюшинном и наименее – при оральном способе введения.

Используя различные схемы пероральной иммунизации кроликов лизат-антигенами, в РНАт и РНГА изучили динамику титров О-антигенов, а также антител к О-антигенам, выявляемым в крови и фекалиях животных. Антиген сальмонелл обнаруживался в фекалиях и в крови животных уже через 12 час. после первого его перорального введения. Выявляемые титры были тем выше, чем большая доза антигена использовалась для иммунизации (рис.1).


В крови максимальные титры антигена выявляли на 3-и сутки, а в фекалиях на 3-5 сутки. Их величина так же носила дозозависимый характер (12,3±0,3, 6,7±0,3, 4,7±0,6 log 2 при дозах эквивалентных 900.109, 450.109 и 225.109 микр. кл. на голову в сутки соответственно).

Общее время обнаружения или время циркуляции антигена в крови было практически одинаковым и равнялось 10-13 суткам при всех 3-х дозах. Третий цикл иммунизации осуществляли только минимальной дозой. В крови, при этом отмечали вдвое меньший подъем титров антигена, чем после первого цикла, а срок его циркуляции сократился с 13 до 4 дней.

Величина титров специфических иммуноглобулинов в крови и фекалиях, а также длительность их циркуляции имели прямую пропорциональную зависимость от дозы антигена, используемой для иммунизации (рис.2). Дробная иммунизация циклами по 3 дня позволяла поддержать титры специфических иммуноглобулинов в отдаленный от начала иммунизации срок (25-30 дней) на более высоком уровне, чем при иммунизации одним циклом, но при этом не позволила достичь тех максимальных величин тиров в ранний поствакциналный период (10-21 сутки), которые обеспечивает один трехдневный цикл в максимальной дозе. Дробная иммунизация циклами по 3 дня не обеспечила и увеличения сроков обнаружения специфических иммуноглобулинов в крови и кишечнике кроликов.


Динамика розеткообразующих клеток в процессе иммунного ответа представлена на рис. 3, из которого видно, что клеточный ответ регистрировался при всех 3-х схемах иммунизации и был наиболее выражен при одном 3-дневном цикле с использованием максимальной дозы. Повторные циклы иммунизации обеспечивали повторное увеличение количества Т- и В-лимфоцитов.Установлен статистически достоверный (р<0,05) рост фагоцитарной активности и отсутствие значимой разницы в динамике этого показателя при всех 3-х циклах. Таким образом, показано, что разделение дробной иммунизации на циклы не целесообразно, поскольку второй и, в особенности, третий циклы происходят на фоне формирующегося иммунного ответа.

Предположили, что более целесообразно использовать дробную иммунизацию не деля ее на циклы, т.е. используя один, но более продолжительный, чем три дня подряд цикл перорального введения антигенов. Предположение проверили в опытах на мышах.Белых мышей (n=20) иммунизировали в течение 5-ти суток подряд дозой антигена, эквивалентной 20 млрд. микр. кл. и в течение 10-ти суток в дозе, эквивалентной 10 млрд. микр. кл. Суммарная доза антигенов во всех группах составляла 100 млрд. микр. кл./гол. Антигены использовали без протектора, с 1% пектина и сорбированными на отрубях. В динамике определяли величины сывороточных и копроантител к О-антигенам сальмонелл.

Из данных таблиц 2 и 3 видно, что уровень копроантител (15-20 сутки наблюдения) был в среднем выше уровня сывороточных на 4-5 разведений или в 16-32 раза. К концу месячного срока наблюдения этот показатель составил 3-4 разведения или 8-16 раз.Таким образом, установлено, что 5-10-кратное введение антигена обеспечивает его длительный контакт с лимфоидной тканью кишечника. Иммунный ответ на антигены с протекторами и без них практически не отличался ни по своей величине, ни по длительности в исследуемые сроки.

Исследование Ig в кишечнике и селезенке мышей линии BALB/c проводили методом ИФА после пероральной (10 дней подряд, группа 1) и однократной подкожной иммунизации (группа 3). Одновременно оценивали параметры клеточного иммунитета. Отмечался подъем уровня IgG (13 log 2, контроль 12 log 2) в селезёнке на 7-е и 14-е сутки при введении лизат-антигена per os. Увеличение IgM в кишечнике (4 log 2, контроль 2 log 2) в 2 раза по сравнению с контролем при пероральном введении происходило на 7-е, а при подкожном на 14-е сутки. При пероральном введении антигена отмечалось значительное повышение IgА в кишечнике (12 log 2, контроль 10 log 2) на 7-е сутки после вакцинации, а IgG на 21-е сутки (13 log 2, контроль 9 log 2).

Отмечалось достоверное (p<0,05) увеличение количества лимфоцитов к 14-м суткам после вакцинации обоими способами (табл. 4). Увеличение количества нейтрофилов на 1-е сутки со снижением на 21-е, связано с общей активацией иммунной системы. Количество моноцитов достоверно возрастало на 1-7-е сутки при пероральной и в течение всего срока наблюдения при подкожной иммунизации. Повышение фагоцитарной активности и фагоцитарного числа у мышей после пероральной иммунизации отмечалось на 7-е сутки 49,3% (контроль 15,8%) и 4,5% (контроль 1,8%) соответственно.

На рис. 4а и 4б видно повышение числа тимоцитов и спленоцитов на 1-е и 7-е сутки после введения антигена по сравнению с контролем, но также видно значительно меньшее количество Т- и В-лимфоцитов по сравнению с показателями при пероральной иммунизации. Таким образом, на лабораторных животных удалось показать возможность формирования как местного мукозального, так и системного противосальмонеллезного иммунитета при пероральном использовании лизат-антигенов возбудителя и отработать оптимальную схему иммунизации. В опыте прямого заражения пероральная иммунизация мышей предлагаемым методом позволила получить разницу в величине LD50 в сравнении с интактными животными в 423,1-692,3 раза, что свидетельствует о выраженной иммуногенности испытуемых антигенов.

В опытах на поросятах в условиях благополучного по сальмонеллезу хозяйства было показано, что интенсивность иммунного ответа носила дозозависимый характер. Максимума титры сывороточных антител достигали к 14 суткам, удерживались на этом уровне в течение 5-7 дней и далее снижались. Титры копроантител достигали максимума к 14-21 дню, после чего их уровень снижался. Копроантитела обнаруживались в значительно большем количестве. Пиковый их уровень (14- 21 дни наблюдения) к S.typhimurium был в среднем выше сывороточных на 4-5 разведений (в 16- 32 раза), а к S.choleraesuis – на 3-6 разведений (в 8-64 раза). Более длительным был и срок обнаружения копроантител – 41 день после иммунизации (срок наблюдения). Достоверных изменений лейкоцитарной формулы крови у опытных поросят в сравнении с контрольными выявлено не было. Установлен дозозависимый характер стимуляции фагоцитарной активности и увеличения числа нейтрофилов к 7-14-м суткам иммунного ответа.

Оптимальной оказалась схема иммунизации, предусматривающая 10-кратное введение антигена в дозе, эквивалентной 600 млрд. микр. кл.на голову.

В условиях неблагополучного по сальмонеллезу хозяйства проведено два производственных опыта, в которых в общей сложности использовали 374 супоростных свиноматки и около 3 тыс.поросят подсосного периода содержания и содержавшихся на участке доращивания. Пероральная иммунизация лизат-антигенами сальмонелл по предлагаемой методике позволила повысить сохранность поросят в сравнении с внутримышечным использованием этих антигенов на 6%, в сравнении с не вакцинированным контролем – на 11,1%, а живую массу поросят к моменту передачи их на откорм на 1,4 и 1,0 кг соответственно.

Таким образом, показано, что лизат-антигены могут быть использованы для разработки средств специфической профилактики сальмонеллеза перорального применения и способны обеспечить эффективный и безопасный с эпизоотической точки зрения, технологичный в использовании метод групповой иммунизации, в результате которого у привитых животных формируется как системный, так и местный иммунитет.

В.В.Суботин, М. Н. Лощинин
ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии

Leave a comment